Doenças cardiovasculares são responsáveis pela maioria das mortes no mundo, causadas pela formação de coágulos sanguíneos em artérias ou vasos. As terapias convencionais apresentam alguns efeitos indesejáveis, então surgem como alternativa para tratamento as enzimas trombolíticas, que degradam a fibrina, principal componente dos coágulos. Elas atuam de forma semelhante a plasmina, e são encontradas em diversas fontes, como bactérias. Este trabalho objetivou obter, caracterizar bioquimicamente e analisar a atividade fibrinogenolítica de uma enzima trombolítica produzida por Bacillus megaterium (IPA-CC65) isolado da cana de açúcar. A enzima foi produzida utilizando fermentação submersa em um meio de cultura modificado e pré-purificada utilizando um sistema de duas fases aquosas (SDFA) com polietilenoglicol (PEG) e fosfato de sódio. Também foi realizada sua caracterização bioquímica, analisando o efeito da temperatura e pH na atividade e estabilidade da enzima, efeito de inibidores e íons na atividade proteásica, SDS-PAGE, zimograma de fibrina, atividade fibrinogenolítica e degradação trombolítica in vitro. O período de fermentação ideal para sua produção foi de 72 horas com uma atividade de 21,82 U/mL, sendo possível observar que a enzima foi particionada para a fase rica em PEG no SDFA. A enzima pré-purificada demonstrou atividade ótima a 50 °C e no pH 10, sugerindo que é uma protease alcalina. Além disso, foi observado que esta é sensível a íons metálicos, especialmente ao manganês, com uma atividade residual de 242,30% e, também, que foi inibida pelo fenilmetilsulfonil fluoreto (PMSF). Indicando assim, seu pertencimento à classe das serino proteases. Sua massa molecular foi de aproximadamente 150 kDa, observando-se também sua atividade sobre o zimograma de fibrina. A enzima demonstrou atividade trombolítica in vitro e degradou a cadeia Aα, Bβ e γ do fibrinogênio em poucos minutos. Essas descobertas evidenciam o potencial dessa protease como possível candidata para o desenvolvimento de novas terapias trombolíticas, sendo o próximo passo a avaliação de seu efeito em organismos vivos em novos estudos.