O consumo de probióticos está diretamente relacionado à benefícios à saúde humana, por isso, a busca e o consumo desses microrganismos tem crescido mundialmente. O kefir é uma bebida láctea fermentada que possui uma grande quantidade de microrganismos probióticos, sendo capaz de promover o equilíbrio da microbiota intestinal. É possível isolar novas cepas probióticas a partir de diversas fontes, como grãos de kefir, leite materno, microbiota intestinal e fezes. Todavia, para garantir os efeitos benéficos e a segurança de uso de novas cepas é necessário realizar uma série de testes exigidos por diferentes agências reguladoras ao redor do mundo. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade oral aguda, subaguda e a mutagenicidade de uma nova cepa de Lacticaseibacillus rhamnosus isolada de grãos de kefir brasileiro. Para a toxicidade oral aguda foram utilizados camundongos tratados com duas concentrações da nova cepa L. rhamnosus de kefir (10 10 e 10 18 UFC/mL), com cepa comercial Lactobacillus rhamnosus GG (10 10 UFC/mL), e com água destilada. Esses animais foram observados por 14 dias com atenção aos sinais clínicos e comportamentais, e registro do peso corporal e consumo da ração. Ao final do período de experimentação os órgãos foram analisados macroscópicamente e foram realizadas análises hematológicas e bioquímicas do sangue. Na toxicidade subaguda foi realizado um tratamento durante 28 dias, utilizando as mesmas concentrações da toxicidade aguda, bem como foram realizadas as análises dos mesmos parâmetros, com acréscimo da análise histomorfometria do fígado, baço, rim, intestino grosso e delgado. Para verificar a mutagenicidade, o teste de micronúcleo foi feito com o sangue dos animais da toxicidade subaguda. Os dados obtidos foram expressos em média e desvio padrão, para as análises estatísticas foi adotado um nível de significância de p < 0,05. Diante dos resultados obtidos, a nova cepa probiótica não apresentou efeitos tóxicos em única dose ou em doses repetidas, em comparação ao controle. Não houve alteração no comportamento dos animais, na massa corpórea, no consumo de ração ou nos parâmetros hematológicos. No entanto, os parâmetros bioquímicos apresentaram uma redução significativa dos níveis de colesterol, glicose e triglicerídeos para os grupos tratados com os probióticos na toxicidade oral aguda e subaguda. Na análise histomorfométrica, pequenas alterações foram encontradas, no entanto, são alterações pontuais e possivelmente reversíveis, uma vez que não foram encontradas outras diferenças significativas relacionadas ao mesmo órgão. No teste de micronúcleo não houve aumento significativo dos eritrócitos policromáticos micronucleados no sangue. Com isso, entende-se que a nova cepa probiótica L. rhamnosus de kefir, não apresentou efeitos tóxicos, assim como não foi mutagênica nessas condições experimentais. Porém são necessários estudos toxicológicos posteriores, principalmente, com períodos mais longos de exposição para garantir a segurança de uso. Além disso, com os achados obtidos, sugere-se que pesquisas futuras investiguem os potenciais efeitos benéficos na redução do colesterol, glicose e triglicerídeos em diferentes concentrações e tempo de exposição.