A síntese verde de nanopartículas de prata (AgNPs) utilizando fungos do gênero Trichoderma representa uma abordagem promissora para diversas aplicações biotecnológicas, especialmente na área biomédica. Neste estudo, AgNPs foram biossintetizadas a partir dos extratos celulares de oito linhagens de Trichoderma e caracterizadas por espectroscopia UV-Vis, potencial Zeta, DLS e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os resultados indicaram que as linhagens Trichoderma sp. UFPIT08 e T. orientale UFPIT09 produziram AgNPs altamente estáveis e monodispersas. A síntese foi favorecida por um pH neutro ou levemente ácido (6-8), enquanto fatores como o meio de pré-inóculo e a temperatura influenciaram a estabilidade, o tamanho e a dispersão das nanopartículas. Trichoderma sp. UFPIT08, cultivado em meio BDA a 30°C, sintetizou AgNPs em 24 horas, com potencial Zeta de -29 mV e tamanho médio de 167,8 nm. Já T. orientale UFPIT09 apresentou AgNPs com aproximadamente 199 nm após 120 horas de síntese, com potencial Zeta de -38,9 mV. As análises indicaram que as AgNPs biossintetizadas possuem propriedades antibacterianas contra diversas cepas, incluindo bactérias multirresistentes (Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae), com halos de inibição variando entre 3 e 14 mm, além de eficácia na inibição e erradicação de biofilmes bacterianos. Além disso, os testes de citotoxicidade revelaram atividade anticancerígena dependente da dose contra células de adenocarcinoma mamário humano (MDA-MB-231). Portanto, o presente estudo revela o potencial biotecnológico de Trichoderma sp. UFPIT08 e T. orientale UFPIT09 na síntese verde de AgNPs, destacando sua aplicação como agentes antibacterianos, antibiofilme e anticâncer, com perspectivas para futuros estudos clínicos.